2 月 6 日，据南方周末报道，杭州某医院的一位患者 CT 结果高度疑似新冠病毒感染，但连续 6 次核酸检测结果都为阴性，直到第 7 次才测出阳性得以确诊。还有患者此前几次采样都无法确诊，在确诊时便已病重。
2 月 7 日，据新京报报道，武汉协和医院发现一例特殊病例，该患者治疗后 2 次核酸检测均为阴性，符合出院标准，但肺部影像显示仍有病毒感染迹象，需要继续治疗。
这几例特殊的病例很快引起了广泛的关注，它几乎颠覆了我们以往对于核酸检测作为确诊新冠肺炎金标准的认知——为什么会出现这样的情况？核酸检测还能继续用吗？我们要怎样降低核酸检测的假阴性率？
核酸检测的「假阴性」
当我们看到前面的这几个病例，第一反应很可能都是同一个概念：核酸检测的假阴性。
所谓假阴性，即金标准诊断为患者，但筛检试验诊断为非患者（阴性），因此该筛检试验中的阴性是假的。
在统计学中，假阴性、假阳性、特异度、敏感度是四个紧密联系的名词解释题。简单来说，假阴性就是检测结果显示没病，但实际上有病；假阳性则检测结果显示有病，但实际上没病。与之相对的，特异度为真阴性率，灵敏度为真阳性率。
假阴性率越高，则漏诊的人数越多；假阳性率越高，说明被错诊的人数越多……因此，假阴性率或假阳性率越高，这一检测方法也就越不靠谱。特异度与灵敏度越高，那么这一检测方法就越准确。
根据国家卫健委 2 月 5 日发布《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》，病例确诊有两种方法：核酸检测与基因测序，而前者是目前临床上最简便常用的检测手段。
此外，该方案明确的患者解除隔离与出院标准为：体温恢复正常 3 天以上、呼吸道症状明显好转，连续两次呼吸道病原核酸检测阴性（采样时间间隔至少 1 天）。
显然，根据本文开头提及的几个病例，无论从确诊标准还是出院标准上来看，核酸检测结果都出现了与实际情况不一致的现象。
中国医学科学院王辰院长在 2 月 5 日接受专访中提到，此次新冠病毒的核酸检测「对于实际上是这个病的病例，最高有 30～50% 的阳性率」。
为什么会出现这样的假阴性情况？
采样：下呼吸道阳性率高于上呼吸道
目前，最常用的采样方式为咽拭子，采样部位在患者上呼吸道，具有速度快、难度小，不容易对患者造成创伤的特点。
但新冠病毒主要感染部位其实是在下呼吸道及肺部，进行咽拭子采上呼吸道样本时，检出结果可能存在假阴性。
此外，病毒复制活跃的程度也会受到个人免疫系统作用的影响，如果患者临床上已经出现症状，但体内病毒量还没有达到可以检测出来的程度，此时进行采样也会出现假阴性结果。
肺泡灌洗检测手段属于对下呼吸道进行采样。近日就有一个「三阴」患者的例子：患者入院前 3 次咽拭子核酸检测均为阴性，直到入院后插管上呼吸机，通过肺泡灌洗检测才发现新冠病毒核酸阳性。
2 月 4 日，国家医疗专家组成员、北京地坛医院感染性疾病诊疗与研究中心首席专家李兴旺表示，「从呼吸道标本而言，肺泡灌洗液的敏感性高于痰的结果，痰的结果高于咽部的结果，所以，危重病人诊断率高就是因为能够采集到肺泡灌洗液。对于普通病人来说，更多取深部痰做检测，可能会把阳性率进一步提高。」
不过，肺泡灌洗液的阳性率虽然高，对于医患双方的操作难度与成本也更高。
苏州市立医院呼吸科主任医师李勇告诉丁香园，「根据以往流感肺炎的经验，上呼吸道采样阳性率往往不及下呼吸道采样。上呼吸道采样技术要求不高，适宜广泛开展，但需要规范化采样；下呼吸道采样虽然阳性率较高，但属于有创操作，费时费力，技术要求高，感控要求也高，因此很难广泛开展。」
试剂盒：研发时间短，质量可能参差不齐
核酸检测需要依赖试剂盒，一般试剂盒的生产与设计往往需要 3～5 年。但在此次疫情中，第一次试剂盒下发距离第一次疫情通报仅有 17 天时间。
在这样极其有限的时间内，可能存在试剂盒研发与临床试验流程简化、临床试验规模缩小、试剂盒质检「品控不一」导致质量不稳定的情况。
在试剂盒的质量评估标准中，有一个叫做「检测限」的概念。
我们可以将检测限理解为「灵敏的嗅觉」。在采集样本中，当病毒数量超过某个值，嗅觉灵敏的狗（即质量较好的试剂盒）能发现病毒，确诊患者，嗅觉不够灵敏的狗（即质量较差的试剂盒）就无法发现病毒。
目前，同一批次生产的试剂盒可能无法保持在一个较低的检测限（能检出的最低病毒核酸含量），不同的企业、试剂之间，精准程度也可能存在差别。
此外，部分试剂说明书要求「需 2 个靶标同时阳性才可报阳性」，单一靶标阳性则报为阴性。对检测结果的解读不同，也可能使得患者被判定为阴性，导致假阴性率上升。
除了试剂盒本身的质量可能参差，对试剂盒检测的操作也会产生影响。
新冠病毒为单链 RNA 病毒，有专家告诉丁香园，核酸试剂的检测能力主要取决于采集标本的时机和提取 RNA 的质量。由于 RNA 容易降解，因此取样标本不能放置太久，一般要求采样后 5 个小时内检测，4℃ 存放不能超过 24 小时。如果存放时间久，要求存放在 -70℃ 冰箱。
一旦在操作过程中出现不规范、温度变化都可能使样本受到污染，影响提取质量，造成假阴性率升高。
假阴性率高，核酸检测还要用吗？
据央视 2 月 5 日对王辰院长的专访，虽然核酸检测阳性率在 30%～50% 之间，但目前尚未出现比核酸检测更加快速、成熟、准确的检测方式。
因此，核酸检测仍是确诊的金标准，仍要继续使用。
不过，对于核酸检测假阴性率高，导致患者无法确诊、无法集中隔离收治、感染蔓延的状况，我们同样可以采取一些改进措施。
在统计学上，有一个「并联试验」的概念：同时应用 2 种诊断方式，只有当 2 种诊断结果都是阴性时，才判定结果为阴性；只要有一种诊断为阳性，就会被判定为阳性。
2 月 3 日，武汉大学中南医院影像科副主任张笑春「建议用 CT 取代核酸检测结果」的朋友圈刷爆网络。
张笑春医生告诉丁香园：「发文并非否定核酸检测结果，而是认为其作为检测的最终手段，目前仍受到产量、采样方式等限制，武汉作为疫区无法在现阶段完全依赖核酸检测去筛查病人，达到切断传染源的防控效果。」
将 CT 等临床标准纳入诊断标准就是一种并联试验的做法。
在 2 月 4 日国家卫健委发布的第五版新冠肺炎诊疗方案中，已将 CT 等临床诊断结果纳入湖北省内病例的诊断标准中：「有流行病学史中的任何一条或无流行病学史，且同时符合临床表现中 2 条」将被列为疑似病例。疑似病例具有肺炎影像学特征者，可以临床诊断为新冠肺炎。
除 CT 检查外，患者临床诊断还包括详细询问流行病史，如果患者是密切接触者或有明确的暴露史，也应当保持高度怀疑。
目前对于疫区而言，最重要的就是保证不漏诊，采取并联试验，牺牲特异度以保证灵敏度，实际上是「疑病从严」的诊断方式。
随着这一诊断标准的修改，我们可以预见的是，湖北地区疑似病例将进一步上升，与此同时漏诊人数也将下降。
2 月 2 日上午，湖北省宣布集中隔离所有疑似病例，实行先隔离再检测、再诊疗，严防交叉感染。
更大的采样范围，更高的检测水平
CT 检查结果虽然有助于筛查假阴性病例，但无法进行鉴别诊断。
张笑春医生也对丁香园强调：「我提的这个建议只适合咱们灾区，不适合普通、散发病例筛查。普通的散病筛查要做到鉴别诊断，而 CT 不能做到鉴别诊断。」
新冠肺炎诊疗方案（试行第五版）在鉴别诊断中提到，「引起社区获得性肺炎的病原多达 100 余种……单从临床表现、胸部影像学难以鉴别，需依靠病原学检测来区分。」
如何完善病原学检测？扩大采样范围。
浙江省中医院重症主任江荣林告诉丁香园，由于使用咽拭子检测阴性率较高，因此在有条件的情况下，采样的优先顺序应为肺泡灌洗-深部痰-鼻咽部-鼻拭子。
有关专家告诉丁香园：「当初筛结果阴性，肺部又有高度疑似的病灶时，建议在严密防护的条件下尽可能做支气管肺泡灌洗。但支气管镜检查气溶胶喷溅，可能引发院感，需要在负压病房内操作，并加强防护。」
苏州大学附属儿童医院药剂科主管药师周密对丁香园表示：「为了减少假阴性，还可以增加采集标本种类。由于部分新冠患者粪便中也会含有病毒，因此初筛时可以增加肛拭子的核酸检测，并将肺泡灌洗液、血液等多部位标本同时送检，多次送检也能够有效提高检出率。」
此外，疫区之外的其他地区医疗压力相对小，还可以采取疾控统一采样的措施。专业人士进行采样可以提高采样的规范程度，确保检测质量，也有助于保证从采样到检测环节的标准统一。
2 月 8 日，贵州省疾控主任张玉琼接受贵州日报采访时表示，贵州已扩大核酸检测范围，3 天进行采样工作 24645 次，达到平时的 6 倍以上。同时，由疾控对医疗机构、第三方检测机构的前三例阳性标本和部分阴性标本进行复核。
除核酸检测方法，有关专家还告诉丁香园，「在肺炎患者病情危重且不排除其他病原体感染的情况下，可以做支气管肺泡灌洗液的基因组测序检查，这也是指南认可的确诊方法。其技术成熟，理论上可以检测所有已知和未知的病原体，而核酸检验只能检测某种单一的微生物。」
但基因测序的主要缺点是昂贵，一份样本的检测费用在 5000 左右，无法报销，不同的商业检测公司收费还会有差别。
写在最后：我们该怎么做？
就目前而言，现有的诊断试剂盒仍属于应急用品，功能仍在不断完善升级，但核酸检测仍属于诊断的最优选择。
对于临床医生而言，在采样过程中做到正确取样，有条件者尽可能取下呼吸道部位样本、多部位采样、多次送检都能够提高核酸检测的阳性率。
根据世界卫生组织 1 月 30 日发布《人感染 2019 新型冠状病毒的全球监测临时指导文件第三版》中针对标本收集的建议：下呼吸道标本似乎比上呼吸道标本对于新冠病毒的诊断价值更高。世卫组织建议尽可能用下呼吸道标本（如痰液、气管吸出物、或支气管肺泡灌洗液）检测新冠病毒。如果患者无下呼吸道疾病的症状和体征或其具有收集下呼吸道标本的临床指征但无法获取时，应收集上呼吸道标本（如鼻咽抽吸物或鼻咽拭子联合口咽拭子）。
对于强烈怀疑为新型冠状病毒感染但初始检测为阴性的患者，应从呼吸道多位点（鼻部、痰液、气管抽吸物）重新采样。还可收集其他样本（如血液、尿液和粪便），用于监测病毒在身体不同部位病毒存在和排出情况。如果血清学检测可行，世卫组织建议尽可能收集急性期和恢复期双份血清用于抗体检测。
此外，还需要对所有症状、流行病学史疑似的患者保持高度警惕，以基因测序、临床诊断等手段作为辅助，将核酸检测与CT 影像诊断结合，临床综合评估，提高新冠肺炎诊断的准确性。
截至 2 月 10 日，根据国家药监局官网消息，已有 7 个试剂盒通过审批。新试剂盒的研发有助于对全国范围真实样本检测的数据进行溯源，检验的准确性也将逐渐提高。
图片来源：国家药监局网站截图
在检测手法不断进步的前提下，现有疑似病例中还会有相当部分得到确诊。
近日，确诊病例的数量仍在不断上升，疑似病例每日增加的例数为 3000 例左右。直到疑似病例开始下降时，疫情发展才能真正迎来拐点。（责任编辑：陈以寒、gyouza）
致谢 本文经苏州大学附属儿童医院药剂科主管药师 周密，西部战区总医院呼吸与危重症医学科主治医师 连亨宁，苏州市立医院呼吸科主任医师 李勇 专业审核
